ASMS2020 賽默飛線上預熱講座集錦第三期：蛋白組學新技術與熱點

疫情并不能停止分析科學家們技術交流與分享，6月1-12日，質譜界盛會—第68屆美國質譜年會，在線上盛大舉行。在此之前，賽默飛舉辦了線上預熱講座，內容涵蓋LC-MS新產品，以及蛋白組學、生物制藥、代謝組學等應用方向，所有內容現在仍可通過注冊進行線上觀看。

上一期，與大家分享了Surequant靶標定量新方法，這一期繼續(xù)與大家分享講座中涉及的蛋白組學新技術與熱點。

Prosit: 組學水平的深度學習譜圖預測

傳統(tǒng)的質譜搜索引擎在匹配理論與實驗譜圖（PSM）時，不考慮離子強度、碎裂能量等實驗信息。而在DIA方法中，二級譜碎片離子強度以及母離子保留時間對匹配準確性至關重要。來自德國慕尼黑大學的科學家Bernhard Kuster系統(tǒng)介紹了Prosit譜圖預測算法。通過對數據庫中高質量質譜數據的學習，建立深度學習模型可以很好地預測二級譜圖以及保留時間等信息。

通過深度學習對碎片保留時間和離子強度進行準確預測。A, Prosit深度學習機制。B, Prosit用于預測碎片離子強度;  C, 碰撞能量校準的碎片強度預測與實際肽段譜圖更接近（點擊查看大圖）

在DDA中用實驗譜圖與預測譜圖進行匹配打分，也可以大大提高對target肽段的檢出能力（FDR=1%），據Küster介紹，FDR會低10~100倍。作者在多個實驗中驗證了Prosit對多肽二級譜以及保留時間的預測準確性，并展示這種預測能力極大地提高了搜索質量，可以使傳統(tǒng)的target-decoy搜庫方法得到非常大的進步。
 

Prosit深度學習機制提升DDA數據的解析結果。A, Prosit強度預測提高數據庫檢索的可信度；B，Prosit可以在宏蛋白質組大數據搜索空間中實現更可靠的鑒定;  C，Prosit預測也適用于非胰酶酶切肽段尤其是單電荷肽段，提升對HLA peptide的解析結果。（點擊查看大圖）

傳統(tǒng)DIA在建立實驗譜庫時往往要耗費大量的質譜時間，也不能涵蓋樣品中所有肽段的譜圖信息。作者希望通過Prosit深度學習機制可以準確預測二級譜圖及保留時間，直接用于DIA的建庫，只需要提供理論肽段序列信息就可以構建任何物種的譜圖數據庫，可用于多個DIA以及Proteome Discoverer 2.5軟件分析。

Prosit深度學習機制用于DIA分析。A, Prosit可準確預測保留時間；B，Prosit與多個DIA分析軟件合作; C，Prosit也將可以在PD2.5軟件檢索流程中使用。（點擊查看大圖）

單細胞蛋白組學的“食譜”

01

單細胞分析的重要性

異質性：常規(guī)蛋白組學一般為基于細胞群體的研究，這樣的常規(guī)分析不可避免會將大量細胞內的信息平均化。而在腫瘤研究以及生殖發(fā)育等重要的生物學過程中都涉及異質性。

樣品量受限的樣品：例如具有高活力和轉移潛能的CTC細胞（循環(huán)腫瘤細胞），外泌體，細針穿刺和活檢組織切片樣品等。

02

單細胞分析流程優(yōu)化

單細胞蛋白組分析中大的難點是樣品量極少。而常規(guī)蛋白組樣品前處理方法僅適用于大量細胞樣品的處理；使用常規(guī)反應體系時酶解效率低；樣品濃度很低（單細胞樣品）時，同樣降低酶解效率。因此，單細胞蛋白組學分析中，無法直接使用常規(guī)蛋白組學的方法，而是需要對每個過程進行優(yōu)化。該講座中給出了一個單細胞蛋白組學的專屬“食譜”。

其中樣品前處理，色譜分離和質譜分析部分的細節(jié)內容可參見“美夢成真——單細胞蛋白組分析的進化之路”，在此詳細討論講座中的單細胞獲取和如何提高樣品前處理方法易用性。

03

如何獲取單細胞

Ø  顯微操縱獲取單細胞
 

FACS獲取單細胞需要一定的細胞起始量，在總細胞數不多的情況下，可通過顯微操縱獲取單細胞[1]。在顯微鏡的輔助下，使用毛細管直接從細胞懸浮液中吸取單個細胞至nanoPOTS中進行后續(xù)操作。

Ø  熒光激活細胞分選術FACS
 

nanoPOTS芯片，與FACS（熒光激活細胞分選）以及LC-MS聯(lián)用用于單細胞蛋白組分析[2]。

Ø  激光捕獲顯微切割LCM
 

結合nanoPOTS樣品前處理平臺與LCM（激光捕獲顯微切割）的蛋白組成像[3]。

04

提高樣品前處理方法易用性

除了開發(fā)樣品前處理方法之外，研究人員也希望通過提高前處理方法的易用性，可以將該方法推廣至更多的實驗室。

Ø  適當提高反應體系，

應用商品化的微量移液器

在nanoPOTS的樣品前處理過程中，需要使用自制的移液機器人吸取幾十 nL級別的液體，并對操作人員的實驗技巧有一定的要求。因此，研究人員比較了使用稍大的反應體積，例如幾百nL級別（μPOTS）時的分析結果[4]，此時可使用商品化的一些微量移液器即可完成移液。在少于100個細胞的樣品中也能獲得不錯的蛋白和肽段鑒定結果。

Ø  改造較低成本的移液機器人
 

可將商品化的低成本移液機器人改造成可配置微量注射器，可用于nL級別的移液，并進行后續(xù)的樣品前處理。

將單細胞蛋白分析轉變成常規(guī)分析還需要很長的路要走，TMT多重標記、微流控液滴技術、高靈敏度的納升色譜柱、Orbitrap Exploris 480 及具有實時檢索功能的Orbitrap Eclipse儀器以及FAIMS Pro接口勢必會加速單細胞蛋白組的進化路程。

后一期中，我們會繼續(xù)和大家分享線上預熱講座中生物制藥的精彩內容，敬請期待。

參考文獻

[1] Anal. Chem. 2020, 92, 2665−2671

[2] Angew. Chem. Int. Ed., 2018, 57: 12370-12374

[3] Nature Communicaitons, 2020, 11:8

[4] Analytical and Bioanalytical Chemistry volume, 2019, 411: 4587–4596

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