背景介紹

2022年8月1日，由國(guó)家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布YY/T 1805.3-2022《組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品 膠原蛋白 第3部分：基于特征多肽測(cè)定的膠原蛋白含量檢測(cè) 液相色譜-質(zhì)譜法》醫(yī)療器械行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)正式實(shí)施。該標(biāo)準(zhǔn)適用于組織提取純化的膠原蛋白及其膠原類產(chǎn)品中不同類型膠原蛋白特征多肽含量的測(cè)定，并規(guī)定了液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定不同類型膠原蛋白特征多肽含量的方法。該標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)外科植入物和矯形器械標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品分技術(shù)委員會(huì)（SAC/TC110/SC3）歸口，島津中國(guó)創(chuàng)新中心使用LCMS-8050參與了新標(biāo)準(zhǔn)的研制和驗(yàn)證工作，助您一起輕松應(yīng)對(duì)新標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用。

膠原蛋白檢測(cè)新標(biāo)準(zhǔn)來襲，您準(zhǔn)備好了么？

標(biāo)準(zhǔn)解讀

膠原蛋白具有良好的生物降解性、生物相容性和弱抗原性，成為應(yīng)用最為廣泛的生物材料之一。膠原蛋白產(chǎn)品屬于大分子，可用液相色譜法、MALDI質(zhì)譜法，凝膠電泳法對(duì)其整體性能進(jìn)行表征。但不同動(dòng)物來源及不同類型的膠原蛋白的結(jié)構(gòu)、分子量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)較為相似，上述傳統(tǒng)方法對(duì)膠原內(nèi)部精細(xì)結(jié)構(gòu)的變化識(shí)別能力有限，無法實(shí)現(xiàn)膠原類別的精準(zhǔn)鑒別。本標(biāo)準(zhǔn)基于液相色譜質(zhì)譜特征多肽法可實(shí)現(xiàn)不同動(dòng)物來源不同類型的膠原蛋白的定性和定量檢測(cè)，為膠原蛋白產(chǎn)品的定性及純度判別提供了依據(jù)。膠原蛋白是大分子纖維狀蛋白，具有三螺旋結(jié)構(gòu)，本標(biāo)準(zhǔn)采用熱變性處理使其三螺旋結(jié)構(gòu)解旋并溶解，胰蛋白酶酶解后對(duì)不同類型膠原的特征肽進(jìn)行檢測(cè)。為了減少質(zhì)譜分析時(shí)基質(zhì)的干擾并提高方法的準(zhǔn)確性，本標(biāo)準(zhǔn)采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。

本標(biāo)準(zhǔn)的頒布對(duì)不同類型膠原產(chǎn)品進(jìn)行精準(zhǔn)鑒別、規(guī)范動(dòng)物源膠原的監(jiān)管、提高膠原產(chǎn)品的理化表征能力和生物安全性等方面具有深遠(yuǎn)的意義。

圖1.《組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品 膠原蛋白

第3部分：基于特征多肽測(cè)定的膠原蛋白

含量檢測(cè) 液相色譜-質(zhì)譜法》醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布稿

特征多肽法的原理：篩選已知序列目標(biāo)蛋白中*且穩(wěn)定存在的肽段，利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)該肽段含量從而推算目標(biāo)蛋白的含量。該方法通常使用胰蛋白酶特異性地酶解精氨酸和賴氨酸的C末端，生成具有堿性氨基酸末端的多肽，因此具有較強(qiáng)的方法專屬性和檢測(cè)靈敏度。目前特征多肽法已成功應(yīng)用于膠類中藥的真?zhèn)舞b別，食品中過敏原的檢測(cè)以及乳品中A2 β-酪蛋白的含量測(cè)定等工作中。

島津解決方案

島津三重四極桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀LCMS-8050采用全新設(shè)計(jì)的加熱ESI源和新型碰撞池UFsweeperⅢ，大幅提高了靈敏度。在確保數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度和精度的同時(shí)，LCMS-8050可實(shí)現(xiàn)555 ch/sec的高速M(fèi)RM采集和5 msec的正負(fù)極性切換。即便對(duì)于未*分離的色譜峰，LCMS-8050也可實(shí)現(xiàn)定量離子、參比離子和內(nèi)標(biāo)離子充分的采集。

Skyline軟件是由西雅圖華盛頓大學(xué)的MacCoss團(tuán)隊(duì)開發(fā)的一款蛋白質(zhì)靶向分析的專業(yè)軟件，實(shí)現(xiàn)了從蛋白質(zhì)到多肽再到MRM離子對(duì)檢測(cè)列表的轉(zhuǎn)化。其獨(dú)特的保留時(shí)間預(yù)測(cè)功能以及碰撞能量預(yù)測(cè)功能使得多肽分析方法的開發(fā)變得更加便捷。島津LabSolutions工作站與Skyline軟件無縫銜接，是靶向蛋白質(zhì)定量方法開發(fā)的得力工具。

分析儀器

表1. 豬I型膠原蛋白特征多肽MRM檢測(cè)參數(shù)

*定量離子對(duì)

豬I型膠原蛋白特征多肽對(duì)照品的典型色譜圖見圖2，二級(jí)質(zhì)譜圖見圖3。

圖2. 豬I型膠原蛋白特征多肽

對(duì)照品典型色譜圖

圖3. 豬I型膠原蛋白特征多肽

對(duì)照品典型二級(jí)質(zhì)譜圖

結(jié) 論

膠原基生物材料中膠原蛋白的含量檢測(cè)是膠原蛋白制品品質(zhì)評(píng)價(jià)，工藝穩(wěn)定性評(píng)價(jià)的重要要素。豬I型膠原海綿是一種重要的醫(yī)用膠原制品，其主要成分豬I型膠原蛋白分子量逾40萬，液質(zhì)聯(lián)用儀無法直接檢測(cè)。本方法采用碳酸氫銨水溶液稀釋并使用胰蛋白酶酶解。通過檢測(cè)豬I型膠原特征肽的含量，折算出膠原海綿中豬I型膠原蛋白的含量。本法具有前處理操作簡(jiǎn)便，方法特異性好，精密度高等優(yōu)點(diǎn)，方法穩(wěn)定可靠，可在膠原醫(yī)療器械產(chǎn)品檢測(cè)領(lǐng)域推廣。

-參考文獻(xiàn) -

《YYT 1805.3-2022 組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品

膠原蛋白第3部分：基于特征多肽測(cè)定的膠原蛋白

含量檢測(cè)——液相色譜-質(zhì)譜法》